Авторы:

Иностранна фирма сЭли Лилли Энд Компани
Иностранцы Роберт Л. Хэмилл Мэрвин Мартин Хоен
Соединенные Штаты Америки
Иностранна фирма сЭли Лилли Энд Компани
Соединенные Штаты Амер ики

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИБИОТИКА А204

Номер патента: 296323


296323

5
торые относительно .простые среды. Например, к числу сред, пригодных для
получения антибиотика, относятся усвояемые источники углерода, такие, как
глюкоза, фруктоза, крахмал, глицерин, мелясса, декстрин, сахар-сырец и т. д.
Лучшим источником углерода является глюкоза. Кроме того, применяемые
среды включают источники усвояемого азота, например соевую муку, замоченную
кукурузу, дрожжи, размолотые семена хлопчатника, мясной экстракт, пептоны (мяса
или сои), казеин, смеси аминокислот и т. п. Лучшими источниками азота являются
пептоны, соевая мука, смеси аминокислот и т. п. Из неорганических питательных
солей, которые могут быть включены в среду, обычно применяются соли, способные
образовывать ионы натрия, калия, аммония, кальция, фосфат-ион, сульфат-ион,
хлорид-ион, карбонат-ион и т. д.
Для оптимального роста и развития штамма в среду необходимо также включать
микроэлементы. Такие элементы обычно присутствуют в малых количествах в других
компонентах среды, причем количество их достаточно для роста используемого
штамма.
Первоначально значение pH среды может быть различным. Однако наиболее
предпочтительно от 6,5 до 7,5. При изучении других ак-тиномицетов наблюдалось
постепенное повышение pH среды в процессе роста организма по мере образования
антибиотика до 7,0—7,6 и выше, причем конечное значение pH, хотя и частично,
зависит от первоначального значения pH среды, присутствующих в среде буферных
компонентов и продолжительности роста организма.
Для получения антибиотика А204 выбраны аэробные условия выращивания в
глубинной культуре. При получении сравнительно небольших количеств можно
применять встряхивание колбы и поверхностное выращивание в- бутылях. Но для
получения больших количеств лучше применять аэробное выращивание в глубинной
культуре в стерильных условиях. Среда в стерильной емкости может
быть инокулирована спорообразующей суспензией. Но ввиду замедления роста,
наблюдаемого при применении спорообразующей суспензии, предпочтительной
является вегетативный ино-кулиум, при этом оборудование для ферментации
используется более эффективно.
Желательно сначала получить вегетативный инокулиум путем инокуляции
сравнительно небольшого количества среды спорами организма, а после того, как
будет получен молодой активный вегетативный инокулиум, перенести его в
асептических условиях в большую емкость. Среда, в которой получается
вегетативный инокулиум, может быть либо той же, какая применяется для
промышленного производства антибиотика А204, либо другой.
Рост организма, дающего антибиотик А204, •происходит в широком интервале
температур от 25 до 37°С. Оптимальной является температура 25—30°С. Обычно
максимальное обра-6
зование антибиотика происходит в течение 48—72 час после инокуляции среды.
Ввиду того, что процесс выращивания проводят в глубинной культуре в аэробных
условиях, через среду продувают стерильный воздух. Для эффективного роста
организма и производства антибиотика А204 расход воздуха, подаваемого в
емкости, составляет от 0,2 до 0,4 объема в 1 мин на 1 объем
культуры. Предпочтительно применять 0,35 объема воздуха в 1 мин на 1 объем
среды.
Концентрацию антибиотика в среде в процессе ферментации можно легко проверять
путем анализа образцов среды на активность замедления роста тест-организмов.
Установлено, что для этой цели можно применять Staphylococcus aureus, Sarcina
lutea, Mycobacterium avium и Bacillus subtilis. Испытание образцов можно
проводить хорошо известными методами нефелометрии или методом колпачка и
пластинки.
Как правило, максимальное образование А204 происходит в течение двух-трех
дней после инокуляции среды в процессе глубинного аэробного выращивания или во
встряхиваемой колбе.
Активный антибиотик, получаемый в процессе ферментации, Monier находиться в
бульоне или в мицелии, либо и там и там. Соответственно, методика выделения,
применяемая при получении А204, рассчитана на максимальное извлечение
антибиотика из любого или обоих источников. Так, например, полученный бульон
можно профильтровать, и фильтрат экстрагировать соответствующим растворителем с
целью извлечения антибиотика, не задержавшегося в лепешке мицелия. Кроме того,
антибиотик, находящийся в лепешке мицелия, извлекается путем тщательной
экстракции соответствующим растворителем. Во всех случаях антибиотик можно
выделить из экстрагирующего растворителя известными методами.
Химический и физический анализ кристаллического А204 свидетельствует о
присутствии четырех-пяти метоксигрупп.
Хроматография антибиотика А204 на бумаге Ватман № 1 дает следующие значения:
Ri=0,14 при применении в качестве растворителя воды, метанола, ацетона и
бензола при объемном соотношении 72:24,5:3:0,5; Rf= = 0,87 при применении в
качестве растворителя 10%-ного водного раствора н-пропанола Rf = 0,33 в
растворителе, содержащем воду, метанол и уксусную кислоту в соотношении 12:3:1
(раствор был доведен до pH 10,4 добавлением NH4OH, а затем до pH 7,3
добавлением Н3РО4). При определении указанных выше данных антибиотик наносили
на бумагу в виде метанольного раствора. Биоавтографы получали, помещая бумажные
хроматограммы на пластинки агара с посевом Bacillus subtilis в качестве тест-
организма.
Если А204 подвергнуть хроматографии в тонком слое на пластинках силикагеля, в.
ра-